Evolution of bacterial meningitis diagnosis in Sao Paulo State-Brazil and future challenges / Evolucao do diagnostico das meningites bacterianas no Estado de Sao Paulo-Brasil e os futuros desafios

Bacterial meningitis (BM) is a severe disease and still represents a serious public health problem with high rates of morbidity and mortality. The most common cases of BM around the world, mainly in Brazil, have been caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae type b. Bacterial culture is the gold-standard technique for BM confirmation, but approximately 50% of suspected cases are not culture-confirmed, due to problems related to improper transportation and seeding or previous antibiotic treatment. Immunological methods present low sensitivity and have possibility of cross-reactions. Real time PCR (qPCR) is a molecular technique and has been successful used for BM diagnosis at Instituto Adolfo Lutz in São Paulo State, Brazil, since 2007. The incorporation of qPCR in the Public Health surveillance routine in our state resulted in diminishing 50% of undetermined BM cases. Our efforts are focused on qPCR implementation in the BM diagnostic routine throughout Brazil.

A meningite bacteriana (MB) é uma doença grave e ainda representa um sério problema de saúde pública, com altas taxas de morbidade e mortalidade. Os casos mais comuns de MB em todo o mundo, principalmente no Brasil, tem sido causados por Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae e Haemophilus influenzae tipo b. Cultura bacteriana é a técnica padrão-ouro para a confirmação de MB, mas cerca de 50% dos casos suspeitos não são confirmados por cultura, devido a problemas relacionados ao transporte inadequado e semeadura ou antibioticoterapia prévia. Métodos imunológicos apresentam baixa sensibilidade e têm possibilidade de reações cruzadas. PCR em tempo real (qPCR) é uma técnica molecular e tem sido utilizada com êxito para o diagnóstico de MB no Instituto Adolfo Lutz, em São Paulo, Brasil, desde 2007. A incorporação da qPCR na rotina de vigilância em Saúde Pública em nosso estado resultou na diminuição de 50% dos casos de MB indeterminadas. Nossos esforços estão focados na implementação da qPCR na rotina diagnóstica de MB em todo o Brasil.

Ocorrência de resultados falso-negativos na reação de PCR em Tempo Real (PCR-TR) no diagnóstico da doença meningocócica / False-negative results in Real-Time PCR (RT-PCR) formeningococcal disease diagnosis

Factors responsible for false-negative results (F-N) in RT-PCR assay for detecting N. meningitidis in serumand CSF samples were investigated. As the meningococcal disease should be rapidly treated because ofits high mortality and epidemic potential, the F-N in diagnostic testing may cause treatment failuresand/or on disease restraint in community. Thus, it is crucial to learn the factors which cause F-N in RTPCRassays. The F-N were induced by inhibition, low quantity of target DNA in extracted samples, andinadequate temperature employed at PCR annealing procedure. As bacterial DNA concentration in samplesmight be highly variable, the ideal sample volume to be extracted could not be defined. As previouslyrecommended for N. meningitidis gene-grouping by RT-PCR assay, the annealing temperature at 60 °Cwas not suitable for B and W135 genogroups. Altogether, these factors induced F-N in 31 samples; therefore,30 % of N. meningitidis detected by RT-PCR were classified as non-genogrouped. The inhibitors and/orthe low amount of target DNA induced F-N on RT-PCR, independently of the specimen volume used forextracting DNA. However, adjustments on the PCR annealing temperature and amount of extracted DNAadded into the reaction might avoid the occurrence of the majority of F-N.

Avaliação de resultados discrepantes obtidos na execução de PCR em tempo real em amostras de pacientes com suspeita clínica de meningite bacteriana / Inconsistent results in real-time PCR in analyzing samples from patients with suspected bacterial meningitis

O princípio básico para obter resultado confiável é a compatibilidade entre as réplicas e suareprodutibilidade. Na rotina diagnóstica por PCR em tempo real (PCR-TR), em que centenas de amostrassão processadas, a obtenção de resultados com Cts tardios ou réplicas que diferem entre si por mais de trêsunidades, são inevitáveis. Das 3.000 amostras processadas em 2010, em duplicata, na rotina diagnósticadas meningites bacterianas por PCR-TR na pesquisa de N. meningitidis, S. pneumoniae e H. influenzae,157 (5,2 %), apresentaram inconsistência entre as réplicas (diferença entre Cts maior do que 3) e/ou altosvalores de Cts; e os ensaios foram retestados. O presente trabalho investigou estes resultados obtidos, osbenefícios destas repetições e as possíveis razões da ocorrência dos resultados discrepantes. Verificouseque, apenas 18 (11 %) das amostras submetidas à repetição, apresentaram resultados positivos. Erroshumanos inerentes à pipetagem, como o uso de pipetas não calibradas, a baixa concentração de DNAalvo nas amostras, a degradação da sonda ou mesmo a possível contaminação aleatória são fatores quecontribuem para induzir resultados discrepantes. A realização do ensaio de PCR-TR com amostras emduplicata e a repetição de ensaios com resultados discordantes é um artifício eficiente para avaliar e definirestes resultados.

Fast test for assessing the susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to isoniazid and rifampin by real-time PCR

Mycobacterium tuberculosis is the bacterium that causes tuberculosis (TB), a leading cause of death from infectious disease worldwide. Rapid diagnosis of resistant strains is important for the control of TB. Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) assays may detect all of the mutations that occur in the M. tuberculosis 81-bp core region of the rpoB gene, which is responsible for resistance to rifampin (RIF) and codon 315 of the katG gene and the inhA ribosomal binding site, which are responsible for isoniazid (INH). The goal of this study was to assess the performance of RT-PCR compared to traditional culture-based methods for determining the drug susceptibility of M. tuberculosis. BACTEC TM MGIT TM 960 was used as the gold standard method for phenotypic drug susceptibility testing. Susceptibilities to INH and RIF were also determined by genotyping of katG, inhA and rpoB genes. RT-PCR based on molecular beacons probes was used to detect specific point mutations associated with resistance. The sensitivities of RT-PCR in detecting INH resistance using katG and inhA targets individually were 55% and 25%, respectively and 73% when combined. The sensitivity of the RT-PCR assay in detecting RIF resistance was 99%. The median time to complete the RT-PCR assay was three-four hours. The specificities for tests were both 100%. Our results confirm that RT-PCR can detect INH and RIF resistance in less than four hours with high sensitivity.

Implantação e otimização da PCR em tempo real para o diagnóstico da influenza A (H1N1) pandêmica no Instituto Adolfo Lutz e perspectivas para 2010 / Implementation and optimization of real time PCR for diagnosis of pandemic influenza A (H1N1) at Instituto Adolfo Lutz and perspectives for 2010

Os autores apresentam sua experiência no diagnóstico laboratorial de InfluenzaA (H1N1) em 37.240 amostras clínicas obtidas de pacientes com suspeita de gripe, encaminhadas ao Instituto Adolfo Lutz para análise. Eles apresentam os algoritmos de testes moleculares empregados, comparam a eficiência dos mesmos quanto à sensibilidade, especificidade e custo e, finalmente sugerem um novo algoritmo para ser usado em caso de nova epidemia de Influenza A (H1N1) em 2010.

The authors present their experience with the molecular diagnosis of Influenza A (H1N1) with 37.240 clinicalsamples obtained from individuals suspected of flu, sent to Instituto Adolfo Lutz for analysis. They show the used algorithms, compare their efficiency in terms of sensitivity, specificity and cost, and suggest a new algorithm to be employed in case of an outbreak of Influenza A (H1N1) in 2010.

Efeito da suplementação com L-alanil-L-glutamina sobre a resposta de hipersensibilidade do tipo tardio em ratos submetidos ao treinamento intenso / Effect of L-glutamine and L-alanyl-L-glutamine supplementation on the response to delayed-type hypersensitivity test (DTH) in rats submitted to intense training

O treinamento intenso e o exercício exaustivo podem ocasionar imunossupressão em atletas por meio da diminuição da concentração plasmática de glutamina. O presente estudo verificou inicialmente o efeito da suplementação com L-glutamina e L-alanil-L-glutamina sobre a resposta ao teste de hipersensibilidade do tipo tardio (HTT) em ratos submetidos ao treinamento intenso em natação durante seis semanas. Posteriormente, foi avaliado o efeito dessas intervenções nutricionais sobre a contagem total e porcentual de leucócitos e concentração sérica de anticorpos IgG anti-albumina de soro bovino, em animais submetidos ao teste de exaustão e recuperados durante o período de 3 horas...

Efeito de emulsoes lipidicas sobre mecanismos de defesa organica na agressao infecciosa / Effect of lipidic emulsions on organic defense mechanisms in infective aggression

Constitui-se o objetivo da presente pesquisa o estudo do efeito de emulsoes lipidicas comercialmente disponiveis de Triglicerides de Cadeia Longa (TCL) e de Triglicerides de Cadeia Media (TCM) e Longa (TCM/TCL) a 10 por cento sobre a funcao de polimorfonucleares (LPMN) de sangue de ratos apos transfusao endovenosa continua em ratos submetidos a agressao infecciosa por meio da inoculacao intraperitoneal de E. coli. Efetuaram-se provas de funcao dos LPMN (atividades fagocitaria, bactericida e quimiotatica), hemoculturas seriadas, avaliacao clinica, autopsia e avaliacao histopatologica do figado e baco e analise de taxa de mortalidade. Nao se observaram diferencas significativas no comportamento funcional dos LPMN do sangue de ratos

Nutriçäo parenteral e desenvolvimento de tumor maligno experimental / Parenteral nutrition and experimental malignant tumor development

Os autores apresentam os resultados diferentes ao desenvolvimento do tumor de Walker 256 implantado em ratos Wistar submetidos a esquema de alimentaçäo oral e Nutriçäo Parenteral (NP). Os animais foram divididos em três conjuntos: grupo OT10 (11 ratos) em que os animais eram acompanhados a partir do 10§ dia do implante tumoral e permaneciam recebendo dieta oral com conteúdo de nitrogênio de 4,32g/100g e valor calórico de 340 cal./100g; grupo PT10 (8 ratos) em que os animais eram submetidos a um esquema de NP a partir do 10§ dia do implante tumoral, de forma a receber em média 144mg de nitrogênio e 22 calorias por 100g de pêso corpóreo em 24 horas, grupo PC10 (17 ratos) em que os animais eram submetidos ao mesmo esquema de NP. Os animais eram acompanhados durante períodos de sete dias. Os resultados näo revelaram diferenças significativas entre os três grupos de animais observados, no que se refere ao pêso corpóreo e ao pêso da carcaça; a comparaçäo ente o pêso do tumor e a relaçäo pêso do tumor/pêso da carcaça entre os grupos OT10 e PT10 näo revelou igualmente diferenças significativas